Das vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) geförderte und bis Dezember 2020 laufende Projekt COLLAR untersuchte, wie die Komplexität von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) die Wahl des Reparaturweges und die Wahrscheinlichkeit mutagener Ergebnisse beeinflusst. Mit Hilfe von konstruierten I-SceI-Endonuklease-Konstrukten erzeugte das Team DSBs definierter Komplexität in einer Reihe von Zelllinien, darunter die menschliche Lungenkarzinomlinie A549, immortalisierte normale Epithelzellen (RPE-1 hTert) und Fibroblasten (82-6 hTert). Die Konstrukte wurden auch in Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO) und in menschliche Knockout-Linien (KO) integriert, die mit CRISPR/Cas9 erzeugt wurden, was eine systematische Untersuchung der wichtigsten Reparaturproteine ermöglicht.
Das auffälligste technische Ergebnis war, dass eine zunehmende Komplexität der DSBs – entweder durch die Anhäufung mehrerer Schnitte innerhalb weniger hundert Basenpaare oder durch die Anordnung von Schnitten in nukleosomgroßen Abständen – zu einem deutlichen Anstieg der Chromosomenaberrationen und -deletionen führte, was durch Multiplex-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (mFISH) bestätigt wurde. Zellüberlebenstests zeigten einen deutlichen dosisabhängigen Rückgang der Lebensfähigkeit bei höherer Komplexität, insbesondere bei Clustern von vier DSBs. Die Daten zeigten auch, dass die räumliche Anordnung der Brüche eine Rolle spielt: Ein Cluster mit einem Abstand von einer Nukleosomenlänge erwies sich als toxischer als zwei eng beieinander liegende Schnitte, und die Ausrichtung der I-SceI-Erkennungsstellen modulierte die Schadensreaktion zusätzlich.
Die Analyse der Reparaturwege zeigte, dass die klassische nicht-homologe Endverbindung (c-NHEJ) die Reparatur einfacher, isolierter DSBs dominiert, während bei komplexen Läsionen die DNA-End-Resektion, die homologe Rekombinationsreparatur (HRR) und die Einzelstrang-Annealing (SSA) zum Tragen kommen. Diese Schlussfolgerung wurde durch Experimente mit CHO-Mutanten gestützt, denen DNA-PKcs oder Ku80 fehlten, Komponenten, die für c-NHEJ essentiell sind. Diese Mutanten zeigten ein deutlich reduziertes Überleben nach der Induktion einfacher DSBs, aber nur bescheidene Auswirkungen auf komplexe Läsionen. Die Hemmung der MRE11-abhängigen Resektionsmaschinerie mit Mirin sensibilisierte resistente nicht-kleinzellige Lungenkarzinomlinien (NSCLC) für Cisplatin, gemessen an erhöhten 53BP1- und Rad51-Foci und höheren Spiegeln von Cisplatin-Addukten, während empfindliche Linien davon nicht betroffen waren. Wichtig ist, dass eine ähnliche Sensibilisierung bei nicht-transformierten Zellen nicht beobachtet wurde, was auf eine tumorspezifische Anfälligkeit hinweist.
Das Projekt untersuchte auch die Wechselwirkung zwischen Cisplatin und ionisierender Strahlung. Die Behandlung mit Cisplatin reduzierte die Anzahl der γ-H2AX-, 53BP1- und Rad51-Foci in allen NSCLC-Linien, veränderte aber nicht das Profil der Strahlenempfindlichkeit zwischen empfindlichen und resistenten Zellen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Cisplatin in erster Linie die DNA-Schadenssignalisierung und nicht die Wahl des Reparaturweges moduliert.
Die Zusammenarbeit war ein entscheidender Faktor für den Erfolg des Projekts. Das Kernteam am University Medical Center in Chicago unter der Leitung von Dian Wang steuerte seine Expertise in der Strahlenbiologie und der Hochdurchsatz-Bildgebung bei. Das Institut für Zellbiologie am Universitätsklinikum Essen, unter der Leitung von Jürgen Thomale, stellte die molekularbiologische und CRISPR/Cas9-Infrastruktur zur Verfügung. Regelmäßige Treffen auf internationalen Konferenzen wie der Gesellschaft für Biologische Strahlenforschung (GBS), der European Radiation Research Society (ERRS) und der Radiation Research Society (RRS) erleichterten den Austausch von Ergebnissen und kritische Diskussionen. Drei Doktorarbeiten von Chaudhary, Hasan und Erol dokumentierten die experimentellen Arbeiten im Detail und bildeten das wissenschaftliche Rückgrat des Berichts. Das Projekt wurde vom BMBF finanziert (Referenz 02NUK043B) und gipfelte in einem umfassenden Bericht, der die Auswirkungen der Komplexität von DSB auf die Reparaturtreue und die therapeutische Reaktion in Krebszellen zusammenfasst.